Название журнала на английском

Scientific journal ISSN 2542-0372

Введение

Повышение урожайности сельскохозяйственных культур в значительной степени зависит от обеспечения их элементами минерального питания, и в первую очередь азотными соединениями. Источником экологически чистого биологического азота в почве являются микроорганизмы, которые способны фиксировать молекулярный азот атмосферы [1].

Использование в практике земледелия биологических препаратов, созданных на основе азотфиксирующих микроорганизмов, является одним их технологических приемов повышения урожайности культурных растений [2].

Почвенные микроорганизмы, принадлежащие к роду Azotobacter, характеризуются рядом положительных эффектов, среди которых определяющим являются способность к фиксации молекулярного азота, синтез соединений гормональной природы, витаминов, антибиотических веществ [1]. Следовательно, исследования возможностей использования этой группы микроорганизмов в практике растениеводства и биологического земледелия являются перспективными.

Таким образом, бактерии рода Azotobacter играют большую роль в жизни растений и повышения плодородия почвы, однако, в Ростовской области эта группа микроорганизмов не достаточно изучена. В этом и состоит основная проблема данного исследования.

Актуальность работы заключается в интересе к азотфиксирующим микроорганизмам, в частности к бактериям рода Azotobacter, который обусловлен необходимостью перехода от химизации сельского хозяйства к биогизации, что требует современных представлений о физиологическом состоянии, адаптационных возможностях и механизмах штаммов рода Azotobacter. Выделение новых почвенных штаммов позволит увеличить плодородие почвы и стимулировать рост растений. Также азотобактер применяют в медицине, пищевой промышленности. Выделение почвенных штаммов - азотфиксаторов очень важно в современном мире.

Цель исследования: выявить штаммы азотофиксирующих бактерий рода Azotobacter из различных почв Ростовской области и установить способность Azotobacter влиять на всхожесть и развитие пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.).

Задачи исследования:

-собрать образцы почв с различных участков;

-провести физико-химический анализ образцов почв;

-выделить из почв азотфиксирующие бактерии;

-провести микроскопическое исследование образцов;

-получить культуральную жидкость для обработки семян пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.);

-оценить влияние обработки семян пшеницы мягкой бактерией Azotobacter.

Объект исследования: бактерии рода Azotobacter —почвенные бактерии, фиксирующие свободный атмосферный азот.

Предмет исследования: методы повышения плодородности почв.

Гипотеза исследования: бактерия Azotobacter, выделенная из почвы обладают микробиологической активностью и стимулируют рост и развитие пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.).

Новизна исследования: анализ штаммов азотофиксирующих бактерий рода Azotobacter из различных почв Ростовской области на предмет их влияния на рост и развитие пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.) проводится впервые. Впервые предложен дешевый, экономичный и экологический безопасный способ внесения культуры Azotobacter chroococcum в почву.

Значение результатов исследования. Эта работа может способствовать достижению второй Цели устойчивого развития «Ликвидация голода, обеспечение продовольственной безопасности и улучшение питания и содействие устойчивому развитию сельского хозяйства», разработанных в 2015 году Генеральной ассамблеей ООН в качестве «Плана достижения лучшего и более устойчивого будущего для всех».

Наша работа является частью большого проекта, запущенного ИХБФМ СО РАН в рамках изучения азотофиксирующих бактерий Российской Федерации. Провести серьёзные микробиологические исследования в рамках школьного проекта не представляется возможным, поэтому оценка собранных образцов почвы Ростовской области будет произведена с использованием научных методов в лабораторию ИХБФМ СО РАН для дальнейшего изучения.

Бактерии рода Azotobacter относятся к свободноживущим азотфиксаторам почвы (ризобактериям) и способны, как и клубеньковые бактерии растений (ризобии), с помощью нитрогеназного комплекса фиксировать молекулярный азот воздуха, превращая его в ион аммония. Бактерии рода Azotobacter населяют экторизосферу (зона почвы с наружной стороны корня) и ризоплану (поверхность корневой системы) различных видов растений, используя экссудаты корневой системы для питания.

Экссудаты из корней растений - это жидкости, выделяемые через корни растений. Эти выделения влияют на ризосферу вокруг корней, подавляя вредные микробы и способствуя росту собственных и родственных растений. Корневая система растений может вырасти сложной из-за разнообразия видов и микроорганизмов, существующих в обычной почве.

В обмен растение получает азот в виде доступных для усвоения соединений, улучшается фосфорное питание растений благодаря растворению труднодоступных почвенных фосфатов в процессе жизнедеятельности ризобактерий, фитогормоны, вырабатываемые ризобактериями, стимулируют рост растений, бактерии рода Azotobacter подавляют развитие фитопатогенных грибов и бактерий.

Способность разных штаммов Azotobacter chroococcum Beijer. влиять на прорастание семян и развитие проростков различных видов растений изучена недостаточно. Хотя в настоящее время этому вопросу уделяется значительное внимание в связи с поиском эффективных штаммов этого вида с целью использования их для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур. Имеются сведения о том, что некоторые штаммы А. сhroococcum способны вступать в симбиотические отношения с пшеницей мягкой (Triticum aestivum L.).

Известно, что бактерии рода Azotobacter образуют ассоциации с пектинолитическими и целлюлозоразрушающими бактериями рода Bacillus, потребляя продукты разложения полимеров бациллами, снабжая их фиксированным азотом, что приводит к ускорению усвоения полимеров и стимуляции азотфиксации. В связи с этим при изучении способности А. сhroococcum непосредственно воздействовать на состояние растений более объективные данные можно получить в условиях эксперимента при культивировании растений на питательном растворе или торфе, поскольку таким образом можно вычленить взаимодействие в системе «растение – А. сhroococcum» в чистом виде, т. е. без участия других видов почвенных бактерий.

В связи с этим нами была оценена способность А. сhroococcum, выделенного из почвы сельскохозяйственных угодий Ростовской области (Россия), влиять на рост и развитие пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.).

Материалы исследования.

В качестве объектов для исследования выбрали образцы почв на различных участках Брянской области, отличающихся по месторасположению и использованию. Были отобраны 20 образцов почв в следующих локациях:

6 проб почв из трех районов Ростовской области (для удобства им были даны короткие названия, представленные в скобках) :

Район 1. г. Миллерово и его окрестности – 3 участка:

- ул. Кукушина – городская земля у дороги (Кукушина);

- ул. Маяковского, огород в городской черте (Маяковского);

- хутор Банникова-Алексеевский (пустырь на окраине поселка) (Пустырь).

Район 2. Окрестности села Большие Салы:

- садоводческое товарищество «Дружба» (огород в сельской местности) (Дружба);

- поле после уборки кукурузы у садов «Дружба» (Поле).

Район 3. Полисадник у здания гимназии № 117 в городе Ростове-на-Дону (урбанизированные земли) (Гимназия).

Методы исследования.

В настоящем исследовании образцы почвы и колоний азотобактера использовались методы, предлагаемые в методичке «Охотники за микробами», разработанной сотрудниками Фонда «Образование», ООО «Живые системы» и сотрудниками Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН и Новосибирского государственного университета [3].

Результаты и обсуждения

Для исследования были выбраны 6 образцов почв, указанных выше. Таким образом, изучаемые образцы были отобраны с территорий, испытывающих разную антропогенную нагрузку и с разной историей.

1.Изучение свойств почвы

Начальным этапом исследования явился анализ физико-химический почвенных образцов. Их результат представлен в таблице 1.

Результат опыта.

Тип почвы во всех образцах –тяжелый суглинок.

Во всех образцах почвы карбонаты не обнаружены.

Мы выяснили, что земля в огороде в городе Миллерово оказалась слабокислой.

Высокое содержание нитратов в почве отмечено для огорода в садах «Дружба». Со слов владельца огорода, он использует минеральные удобрения.

Также высокое содержание нитратов отмечено в почве гимназии № 117, что можно объяснить общим комплексным загрязнением почвы в крупном городе.

Наименьшее содержание нитратов отмечено для огорода в городе Миллерово, где владельцы редко используют минеральные удобрения.

Установлено, что почвами с низким содержанием органического углерода (гумуса) являются почвы с огорода «Дружба», поля возле него, и огорода в городе Миллерово. Это можно объяснить полной уборкой растительных остатков осенью, что препятствует естественному восстановлению плодородия почвы.

Неожиданно низким оказалось содержание гумуса в почвах с пустыря х. Банниково-Алексеевский. Возможно это связано с частыми покосами травы на нем.

Высокое содержание органического углерода отмечено у дороги в городе Миллерово, что связано с нечастой уборкой там листового опада и декоративным покосом травы.

Высокое содержание органического углерода в почве с полисадника гимназии № 117 также связано с достаточным количеством мертвой растительной органики, которая повышает плодородие почвы.

Как мы видим, наиболее «живой» оказалась почва с поля и из садового участка «Дружба», что говорит о высоком содержании микроорганизмов в этих почвах.

Почвы из района города Миллерово, менее богаты микроорганизмами, что связано с недостатками в агротехнике: внесение большого количества минеральных удобрений, осенняя уборка растительных остатков, что препятствует образованию гумуса и ведет с общему снижению её плодородия.

Наиболее «бедной» оказалась почва из палисадника Гимназии № 117, что можно объяснить общими свойствами урбанизированных почв больших городов.

Проведя исследование на поиск колоний Азотобактера, способных разрушать полимеры мы установили, что положительный результат показывают колоний 2- поле у садов «Дружба» и 3-пустырь в хуторе Банниково-Алексеевский.

2.Микробиологическое исследование почвы

Культивирование азотфиксирующих бактерий проводили традиционным методом обрастания комочков на среде Эшби.

Приготовление вспомогательного раствора

В мерную колбу на 1л налили дистиллированной воды 400мл, высыпали в колбу с водой соли NaCl, K2SO4, MgSO4*7H2O и K2HPO4 и перемешали до полного отсутствия осадка на дне колбы. Довели объём раствора до отметки 1л.

Приготовление среды Эшби.

На весах подготовили навески: СaCO3-1г, Агара-3г, глюкозы-4г. В химический стакан налили 200мл вспомогательного раствора, перенесли туда все навески. Смесь перемешали до состояния однородной взвеси. Смесь вскипятили на плите, охладили до 500С и заполнили ею чашки Петри.

Увлажнённую почву с помощью одноразовых зубочисток комочками диаметром 3-4 мм по 50 комочков перенесли в каждую чашку с питательной средой. Работу проводили возле горящих спиртовок. Чашки Петри накрыли крышками и убрали в шкаф при комнатной температуре.

Провели наблюдение за ростом колоний на 3, 7 и 10 день после посева.

Микроскопическое исследование бактерий проводили с окрашиванием фуксином Циля и тушью, при увеличении х400 с водной иммерсией.

Протёрли предметные стёкла спиртовой салфеткой для удаления загрязнений и жирового слоя. Прокалили микробиологические петли над спиртовкой, нанесли на стёкла небольшое количество биомассы, с помощью пипетки Пастера добавили по капельке фуксина Циля и туши, перемешали красители и биомассу до равномерного тонкого слоя грязно - розового цвета. Получившийся препарат высушили на воздухе. На препарат нанесли каплю воды и изучили с помощью микроскопа при увеличении х400.

Определили по атласу бактерий наиболее распространенный и хорошо изученный Azotobacter chroococcum (обитает в почвах всех типов, кроме кислых) образует колонии с бурым, почти чёрным пигментом. Клетки бактерий рода Azotobacter относительно крупные (1–2 мкм в диаметре) и, имеют овальную форму. На микроскопических препаратах клетки располагаются одиночно, парами, неправильными скоплениями. Результаты эксперимента сфотографировали (х800); зафиксировали данные наблюдений.

Исследование способности бактерий к накоплению полимерных соединений проводили с окрашиванием суданом чёрным.

На предметных стёклах маркером нарисовали круги, перевернули стёкла, с помощью пипетки Пастера нанесли в центр каждого круга по капле дистиллированной воды, микробиологической петлёй перенесли небольшое количество биомассы с 4 колоний каждого образца почвы, разболтали колонии в воде. Капли подсушили на воздухе до полного исчезновения влаги, зафиксировали препарат с помощью пламени спиртовки. После остывания стекла на каждое пятно нанесли каплю судана чёрного и оставили на 15 минут при комнатной температуре. После высыхания промыли пятна изопропанолом. Проанализировали интенсивность окраски пятен, если после промывки стекла бактерии окрасились в голубой цвет, значит они способны активно накапливать полимеров в своих клетках.

Результаты выявления способности бактерий к накоплению полимерных соединений

Проведя исследование на поиск колоний Азотобактера, способных разрушать полимеры мы установили, что положительный результат показывают колоний 2- поле у садов «Дружба» и 3-пустырь в хуторе Банниково-Алексеевский.

3.Изучение влияния А. сhroococcum на прорастание, рост и развитие растений

Бактерии рода Azotobacter населяют экторизосферу (зона почвы с наружной стороны корня) и ризоплану (поверхность корневой системы) различных видов небобовых растений [1], используя экссудаты корневой системы для питания. В обмен растение получает азот в виде доступных для усвоения соединений, улучшается фосфорное питание растений благодаря растворению труднодоступных почвенных фосфатов в процессе жизнедеятельности ризобактерий, фитогормоны, вырабатываемые ризобактериями, стимулируют рост растений, бактерии рода Azotobacter подавляют развитие фитопатогенных грибов и бактерий [2]. Способность разных штаммов Azotobacter chroococcum Beijer. влиять на прорастание семян и развитие проростков различных видов растений изучена недостаточно [2]. Хотя в настоящее время этому вопросу уделяется значительное внимание в связи с поиском эффективных штаммов этого вида с целью использования их для повышения продуктивности сельскохозяйственных культур [2]. Имеются сведения о том, что некоторые штаммы А. сhroococcum способны вступать в симбиотические отношения с пшеницей мягкой (Triticum aestivum L.) [2].

По плану нашего эксперимента с Azotobacter chroococcum Beijer был заложен опыт по его влиянию на прорастание семян пшеницы мягкой (Triticum aestivum L.). Результаты исследования представлены в таблице 2.

Следующим этапом исследования стало изучение влияния бактерий рода Azotobacter на развитие растений. Для этого мы использовали семена пшеницы.

Предварительно, до эксперимента, сухие семена пшеницы поместили в кусочек марли, смочили водой и оставили для набухания на два часа.

Набухшие семена пшеницы посадили по 10 штук в четыре горшка:

- контроль: 10 набухших семян без обработки;

- вариант 1: 10 набухших семян обработаны культурой Азотобактер;

- вариант 2: 10 набухших семян обработаны культурой Азотобактер + в землю внесена культура Азотобактер с водой;

- вариант 3: 10 набухших семян обработаны культурой Азотобактер + в землю внесена культура Азотобактер на полосках бумажной салфетки.

Для контроля несколько семян пшеницы оставлены без обработки. Прочие обработаны полученным азотобактером.

Почва, смесь торфа, песка и керамзитовой крошки, была куплена в магазине для садоводов и предназначена для рассады. В каждый горшок помещено по 100 грамм почвы.

В процессе эксперимента земля регулярно увлажнялась путем полива 25 мЛ воды.

В процессе эксперимента проводилось по два наблюдения в одно и тоже время (5.00 и 17.00 часов).

На 14 день после начала эксперимента проведено сравнение экспериментальных и контрольных образцов.

Результаты опыта

Результаты опыта показывают, что Вариант 1 показал наименьшую всхожесть семян (50%). Наибольшая всхожесть семян отмечена в Варианте 2 (80%).

Растения в Варианте 2 показали наивысшие показатели по общей длине растений и общей биомассе (урожайность), по длине и биомассе корней.

Общим выводом по данному опыту можно считать следующий:

Результаты опыта показали, что Azotobacter chroococcum Beijer. оказывает влияние и на прорастание и развитие семян пшеницы мягкой, что уточняет ранее известные данные (Ерофеева, 2019).

Результаты опыта подтвердили, что Azotobacter chroococcum Beijer оказывает стимулирующее влияние на развитие проростков пшеницы мягкой, но угнетает прорастание семян пшеницы.

Результаты опыта показали, что внесение Azotobacter chroococcum Beijer в почву при посадке пшеницы мягкой ведет к увеличению всхожести на 10 % и увеличению зеленой массы на 137,5 % по сравнению с Контролем.

С целью проверки достоверности результата опыта было проведено микробиологическое исследование на наличие микробов Azotobacter chroococcum Beijer. в чашки Петри было высеяно по 20 комочков почвы по стандартной методике «Охотники за микробами».

На четвертый день было проведено изучение образцов почвы. Результаты опыта следующие:

Контроль - обрастаний Azotobacter chroococcum Beijer. – 0, комочки посеянные плесенью – 8;

1 вариант - обрастаний Azotobacter chroococcum Beijer. – 2 (10%), комочки посеянные плесенью – 2;

2 вариант - обрастаний Azotobacter chroococcum Beijer. – 20 (100%), комочки посеянные плесенью – 0;

3 вариант - обрастаний Azotobacter chroococcum Beijer. – 20 (100%), комочки посеянные плесенью – 0;

Общим выводом по данному опыту можно считать следующий: для достижения повышения урожайности пшеницы мягкой необходимо вносить культуру Azotobacter chroococcum Beijer непосредственно в почву.

Мы рекомендуем для этого использовать пропитанные культурой Azotobacter chroococcum и высушенные полоски из материал, из которого изготовляют бумажные салфетки. Это не дорогой материал из чистой целлюлозы, который разлагается без останков в почве. Внесение в почву культуры Azotobacter chroococcum в такой форме значительно дешевле, чем внесение его в виде полива.

Выводы

Собранные образцы почвы относятся к тяжело суглинистым безкарбонатным;

земля в огороде в городе Миллерово оказалась слабокислой;

Высокое содержание нитратов в почве отмечено для огорода в садах «Дружба» и палисадника Гимназии № 117;

Почвами с низким содержанием органического углерода (гумуса) являются почвы с огорода «Дружба», поля возле него, и огорода в городе Миллерово;

Наиболее «живой» оказалась почва с поля и из садового участка «Дружба», что говорит о высоком содержании микроорганизмов в этих почвах;

Все почвенные образцы содержали Azotobacter chroococcum;

Колоний Azotobacter chroococcum № 2- поле у садов «Дружба» и № 3-пустырь в хуторе Банниково-Алексеевский показали способность к накоплению полимерных соединений;

Azotobacter chroococcum Beijer. Оказывает стимулирующее влияние на рост и развитие проростков пшеницы мягкой, но угнетает их прорастание, что уточняет ранее известные данные;

Результаты опыта подтвердили, что Azotobacter chroococcum Beijer оказывает стимулирующее влияние на развитие проростков пшеницы мягкой;

Результаты опыта показали, что внесение Azotobacter chroococcum Beijer в почву при посадке пшеницы мягкой ведет к увеличению всхожести на 10 % и общей урожайности на 137,5 % по сравнению с Контролем.

Бактерии Azotobacter chroococcum Beijer. стимулирует рост и развитие проросткой пшеницы мягкой. Гипотеза исследования подтверждена.

Рекомендации

Мы рекомендуем для этого использовать пропитанные культурой Azotobacter chroococcum и высушенные полоски из материал, из которого изготовляют бумажные салфетки. Это не дорогой материал, который разлагается без останков в почве. Внесение в почву культуры Azotobacter chroococcum в такой форме значительно дешевле, чем внесение в виде полива.